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细胞培养与接种的奇妙之旅

    

细胞增殖分化到铺满细胞瓶时,就需要把细胞消化并传代培养。细胞消化过程是这样的:把细胞瓶内旧的培养基倒出来,加入2毫升无菌PBS洗去多余杂质,然后加入2 - 3毫升胰蛋白酶溶液进行消化。在荧光显微镜下观察细胞形态,把细胞瓶放在倒置显微镜上看,看到大多数细胞收缩成球状时,马上停止消化,一般消化时间跟细胞密度成正比。停止消化的方法是:把细胞瓶内胰蛋白酶除去,然后沿着细胞瓶口慢慢加入2毫升培养基,轻轻晃动后倒掉,这个过程要注意防止细胞大面积漂浮,然后倒掉含有胰蛋白酶的培养基,用移液枪吸3 - 4毫升新培养基,冲洗细胞瓶里的细胞,多次吹打直到绝大部分细胞漂浮,消化完成后把旧细胞瓶里一部分细胞转移到新的培养瓶里。含有细胞的培养基和新鲜培养基按1 : 3的比例加到新细胞瓶里。细胞每消化一次就是一代。细胞培养到第3代左右就可以用来进行细胞接种。
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细胞接种是考察材料生物相容性之前的必要步骤。细胞接种就是把含有一定密度细胞的培养基滴到试样表面,让细胞黏附在样品表面。一般在多孔板里进行细胞接种。接种实验具体操作过程如下:首先准备样品,把样品放在孔板里,往孔里加入消毒酒精没过样品表面,在紫外灯下静置30分钟来杀菌。然后用无菌PBS清洗样品3次,每次间隔20分钟,把残留的酒精去掉,之后把含有样品的孔板放在无菌环境里备用;其次接种,选择细胞铺满培养瓶底面积90%左右的细胞进行消化。消化后,吸取1毫升细胞悬浊液加到细胞计数板上,在荧光显微镜下观察并计数,根据实验要求把不同密度的细胞接种到试样表面。每个多孔板要留一个空白孔(只接种细胞,没有试样),方便观察细胞在多孔板里的生长情况;最后培养,按照实验要求更换培养基,方法跟之前一样。
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细胞活死实验能定性地表示材料对细胞的毒性。活死染色剂要用PBS配置。Live/Dead荧光染色试剂盒里有两种不同的染色剂原料:钙黄绿素 - AM(Calcein - AM)和溴乙啡锭二聚体(EthD - 1)。在10毫升的PBS溶液里同时加入5微升的Calcein - AM和20微升的EthD - 1就能得到活死染色剂。一般不使用的时候,活死染色剂要避光保存在 - 20℃的环境里。使用时在37℃下避光加热融化,要避免多次冻融活死染色剂。活死染色剂的两种成分分别与活细胞和死细胞发生作用,在特定波长的光下,活细胞会呈现绿色,死细胞呈现红色。活死检测的实验方法如下:细胞接种到样品表面培养一段时间后,把培养基去掉,用无菌PBS清洗3次,把试样转移到新的孔里,考虑到试样的表面积,每个试样表面滴加大约30 - 50微升活死荧光染色剂,避光静置40分钟。在观察之前再用PBS把不需要的活死染色剂洗掉,然后用激光共聚焦显微镜观察拍照。

2024-12-27 11:24:24